免疫沉淀实验是生物医药领域中研究蛋白质相互作用及其表达状态的重要技术。根据实验的特定需求，可以采用不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合，以捕捉目标蛋白。此方法操作简便、快速，分离效率高，非常适合高通量筛选和自动化实验。通过磁性分离架，磁珠可以快速分离，使实验步骤更加高效。此外，在研究蛋白质-蛋白质相互作用和信号传导途径时，磁珠免疫沉淀法尤为突出。

固定免疫沉淀法

固定免疫沉淀法则是使用固定化抗体（通常偶联在珠子上）来捕获目标蛋白，通常用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。虽然此方法需要更长的孵育时间以形成免疫复合物，但可提供高特异性和灵敏度，特别适合定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰和蛋白质稳定性方面极为重要。

实验操作步骤

所需溶液与试剂

• PBS缓冲液
• 1×细胞裂解缓冲液：20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1μg/ml 亮抑制肽。
• 3× SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝。

注意：上述溶液均用超纯水制备，细胞裂解液在使用前需添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基，根据实验目的，添加新鲜培养基对细胞处理一段时间。
2. 用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。
3. 每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
4. 置于冰上孵育5分钟。
5. 轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，置于冰上。
6. 在冰上对样品超声处理四次，每次5秒。
7. 在4°C下微量离心10分钟，将上清液转移到新试管中。
8. 如不进行后续实验，需将裂解物保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

1. 取200μl细胞裂解物，添加10μl固定抗体，置于摇床轻轻摇动，在4°C下孵育过夜。
2. 于4°C条件下微量离心30秒。
3. 用500μl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物清洗，离心去除上清，共清洗五次，期间保持样品冰上。
4. 使用20μl 3× SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋振荡后微量离心30秒。
5. 加热样品至95-100°C，持续2-5分钟。
6. 取15-30μl样品上样到SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验（请参阅针对蛋白质免疫印迹法的具体步骤）。

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