在生物医疗研究中，无论是试图在体外感染难度较大的细胞制作慢病毒文库，还是在体内使用AAV文库，如何确定最佳剂量以确保每个靶点只进入一个细胞，始终是让研究人员困惑的问题。文库实验旨在寻找由单基因引发的功能变化，因此必须控制每个细胞只被携带一个靶点的病毒感染。对于细胞实验，建议在进行文库筛选之前，借助对照病毒进行预实验以摸索最佳的MOI（感染效率达到80%的MOI）。

实际文库操作中的MOI可以设定为最佳MOI的三分之一，这样可以减少病毒用量，以确保控制进入单个细胞的病毒数量。然而，对于难以感染的细胞，如免疫细胞，以及在体内进行的实验，确定最佳剂量以保证每个靶点只感染一个细胞则较为复杂。因为在这种情况下，最佳MOI可能仅能达到30%的感染效率，如果按照三分之一的用量，则几乎无法获得成功感染的细胞。

针对这一难题，尊龙凯时推出了三色荧光病毒（包括mTagBFP、Venus、mCherry），为研究人员进行文库感染的预实验提供了有力支持。这些病毒产品涵盖了慢病毒和AAV两种类型，可以帮助科学家更有效地探索合适的感染剂量。

文献《Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq》为研究者提供了三色荧光病毒在体内AAV文库剂量测试的实验方法。作者通过进行体内滴定实验，使用了三种不同剂量的AAV（分别为25E9、5E9、5E10颗粒数，血清型为phpb），并在CBh启动子的控制下独立表达mTagBFP、Venus和mCherry，通过流式细胞筛选确定了较少的剂量和较少的双病毒感染同一细胞的情况，从而选择了5E9作为最佳剂量，因为该剂量下单个AAV感染的细胞总数得以最大化。

在进行相关实验时，研究人员可将三种AAV的等比例混合物注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中（低剂量25E9; 中剂量50E9; 高剂量25E10），以分析细胞核感染的百分比和感染细胞核中表达1个、2个或3个荧光的比例。无论是在细胞实验还是动物实验中，使用尊龙凯时的三色荧光病毒进行预实验均可获得理想效果。通过在不同剂量下进行流式分析，可以确定单病毒感染比例最高且感染细胞数量最多的最佳剂量，并将这一最佳剂量应用于文库的实际实验中。

参考文献：Santinha, AJ, Klingler, E, Kuhn, M et al. Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq. Nature 622, 367–375 (2023).