**一、细胞培养条件**

**细胞名称**: 生长特性、贴壁生长。

**冻存条件**: 无血清冻存液。

**培养体系**: 基础培养基由1:1混合的MCDB105培养基（最终浓度15g/L碳酸氢钠）和M199培养基（最终浓度22g/L碳酸氢钠）组成，配以优质胎牛血清（15%）和双抗（1%）。

**传代方法**: 首次建议采用1:2的传代比例。传代情况为：每2天更换培养液。

**备注**: 使用无菌离心管收集培养基，以便进行对比培养。如对比效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

**二、细胞收到后的处理**

收到细胞后，将其培养至良好状态，然后灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。在收到细胞后，先用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放入超净工作台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议40x，100x，200x各一张）。前3天的照片为重要的售后依据，若未提供照片则默认收到状态良好。尊龙凯时建议传代后使用一瓶原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基以便进行对比培养，换液后将瓶盖轻松旋松。

**三、细胞培养步骤**

**a. 细胞传代**: 如果细胞汇合度未超过80%，应将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，再放入37℃、5% CO2的培养箱中培养；当细胞密度超过80%时，进行传代培养，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况。如果细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，悬液转移至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补充1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

**b. 细胞冻存**:

1. 细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶，翻转观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。若后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放超过24小时再转入液氮罐。

**细胞复苏**: 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%酒精消毒管外壁；将管中细胞转移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；弃去上清后，加入5ml完全培养基进行重悬，接种至T25培养瓶，并放于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养；第二天，换用新鲜的完全培养基。注意事项：某些细胞可能在运输过程中因粘附不牢而脱落，这是正常现象。如脱落较多，可将所有培养液收集至离心管，利用上清进行过渡培养（后期可作对比），沉淀后添加胰酶，在细胞培养箱中培养。

**四、售后条款**

1）细胞出现问题后可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 涉及运输中出现的各种问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重泄漏等，均可重发；
2. 如果在收到产品48小时内发现细胞污染问题，需提供真实的实验结果，经核实后可重发；
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰冻存的细胞在复苏后的24小时内，若绝大多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片），也可重发；
4. 干冰发货的细胞在复苏后24小时或常温发货的细胞静置4小时未开封而出现污染，均可重发；
5. 如果细胞活性出现问题，请在收到产品7天内提供真实的实验结果，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后可重发；
6. 在细胞收到当天以及第2、3天内拍照记录，若未在3天内反馈，视为产品合格。若在4-7天内出现问题，需提供收到细胞头3天的照片与细胞异常时的照片及相关操作的详细步骤，经过技术人员判断为我方责任的，将予以重发。若判定为双方责任，由双方协商处理，或按照合同价的50%收费重发。

2）细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
1. 若客户造成细胞污染，将不予重发；
2. 客户因不当操作导致细胞状态不佳，也不予重发；
3. 使用非推荐细胞培养体系导致细胞状态不良，将不予重发；
4. 细胞状态不佳且未提供前3天的照片，亦不予重发；
5. 细胞培养时有其他处理的，亦不予重发；
6. 若细胞在收到2天内未反馈，将不予重发；
7. 具体情况视情况而定。